U-Ch1 人骶骨脊索瘤細(xì)胞/STR鑒定

細(xì)胞介紹

U-CH1 是一種間充質(zhì)樣細(xì)胞系，于 1998 年從一名 56 歲白人男性脊索瘤患者的骶骨中分離出來(lái)。該細(xì)胞系是根據(jù)初次手術(shù) 4 年后放療后骶尾部局部復(fù)發(fā)建立的。脊索瘤是一種罕見(jiàn)的生長(zhǎng)緩慢的腫瘤類型，U-CH1是一種生長(zhǎng)相對(duì)緩慢的細(xì)胞系。U-CH1具有由漿細(xì)胞和粘液性細(xì)胞間質(zhì)組成的異質(zhì)形態(tài)，代表典型的脊索瘤特征。這些細(xì)胞過(guò)度表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 T (Brachyury)，這是脊索瘤最特異的標(biāo)志物。

細(xì)胞特性

1） 來(lái)源： 56歲白人男性脊索瘤患者的骶骨

2） 形態(tài)：間充質(zhì)樣，具有可變液泡（長(zhǎng)梭形 不規(guī)則形狀）貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1x106  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理

1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2）請(qǐng)?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過(guò)程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完quan培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過(guò)程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完quan培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

U-Ch1 人骶骨脊索瘤細(xì)胞/STR鑒定      

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

1） 準(zhǔn)備IMDM（推薦iCell-0008）加RPMI-1640（推薦iCell-0002）(4:1) 培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%； 1 % L-谷an酰胺；雙抗，1%。

注意：

1、使用大鼠尾 I 型膠原蛋白（BD Biosciences，目錄號(hào) 354236）稀釋至 50 μg/ml。將 2-3 ml 包被緩沖液加入燒瓶中，并在室溫下孵育一小時(shí)或者使用細(xì)胞包被工作液（推薦iCell-8280）。小心吸出剩余溶液。使用 1x DPBS 沖洗燒瓶 2 次以去除酸。涂層燒瓶可立即使用，或在無(wú)菌條件下于 2-8 ℃保存長(zhǎng)達(dá)一周。

2、該細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。倍增時(shí)間1周多，發(fā)貨估計(jì)3-4周 左右。  

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完quan培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完quan培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完quan培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白mei-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化直至細(xì)胞層分散（通常在 5 至 15 分鐘內(nèi)）以使培養(yǎng)基達(dá)到正常 pH 值（7.0 至 7.6），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，為避免結(jié)塊，在等待細(xì)胞分離時(shí)請(qǐng)勿敲擊或搖動(dòng)燒瓶來(lái)攪動(dòng)細(xì)胞。難以分離的細(xì)胞可置于37°C以利于分散。若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的wan全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。